ELISA，即酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种在免疫荧光和放射免疫技术发展后衍生出的免疫酶技术。它主要用于检测抗原或抗体的浓度，是生物医疗领域常用的实验方法之一。

显色过程

ELISA中的显色反应是实验的最后一步，酶催化无色底物生成有色产品。反应的温度和时间对显色有重要影响。在一定时间内，阴性孔依然保持无色，而阳性孔的颜色会随着时间的延长而加深。提高反应温度可以加速显色。定量分析时，需准确控制底物加入后的反应条件；而定性测定可以在室温下进行，时间控制较为灵活。

常用底物及其特点

在ELISA中，OPD底物的显色通常在室温或37℃反应20-30分钟后达到稳定，过长的反应时间会提高本底值。值得注意的是，OPD底物应避免光照，因为它会自行变色；反应结束时需加入终止液。终止后，OPD产物的颜色会从橙黄色转变为棕黄色。

相比之下，TMB底物受光照影响较小，可以在室温下进行观察。但为了保证结果稳定，阅读结果时应在规定时间内进行。TMB经HRP作用后约40分钟显色达到顶峰，随后逐渐减弱，至2小时后可消失至无色。对于TMB，酶抑制剂如叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)可有效终止反应，并保持蓝色颜色较长时间。

ELISA实验中常见问题解析

ELISA过程中常见的问题主要集中在标曲和样本的显色情况。以下是一些常见问题的解析：

1. 标曲不显色或显色很弱

此情况可能因标准品未充分溶解而导致，建议在溶解标准品及倍比稀释时都进行涡旋震荡，以确保充分混匀。

2. 标曲和样本均不显色

若在孵育阶段静置于桌面上，可能会影响抗原与抗体的接触，导致显色偏弱。推荐使用ELISA专用的微孔板振荡器，以确保充分接触。

3. 标曲显色，样本不显色

遇此情况时，许多人可能将其归因于试剂盒的问题。但实际上，当样本中的目标蛋白浓度极低时，可能导致检测失败。尽管ELISA是蛋白检测灵敏度最高的方法，使用高敏ELISA可能提高可测率，但未必能保证检测到样本。

4. 标曲和样本均显色，但复孔的CV大

此问题通常与移液器的使用及实验者的操作习惯有关。规范使用移液器、保持加样一致性可以减少误差。

需要强调的是，选择正确的标准品稀释液有助于提高样本值的准确性，进而保证实验结果的可靠性。通过合理的操作及使用优质的检测工具，如尊龙凯时(中国区)人生就是搏，可以在生物医疗实验中获得更为准确的结果。