通过体外转录（IVT）获得的mRNA反应混合物中，除了目标mRNA产物外，还包括如T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、盐离子、模板DNA及各类添加剂等杂质。这些杂质可能会对mRNA的功能产生负面影响，例如影响mRNA的定量、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，纯化技术在从IVT混合物中提取目标mRNA时显得尤为重要，以确保产品的纯度和完整性，从而提升其安全性和有效性。

常见的mRNA纯化方法包括氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化以及层析纯化。其中，沉淀、磁珠和硅胶柱的方法操作简单，但其纯化效率有限，因此多用于科研和早期研究阶段。在工业生产中，层析纯化是主要的纯化手段。

硫酸铵沉淀法

在2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队探讨了硫酸铵沉淀法在mRNA纯化中的可行性，其研究对象为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码的mRNA。当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。此外，研究表明，溶解率对最终回收率至关重要。在室温下，当硫酸铵浓度高于18M时，沉淀物在不含RNase的水中可快速溶解，溶解率超过90%。最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS）、pH 7.0、温度20℃，沉淀时间2小时，达到近100%的沉淀率和溶出率。

硅胶柱膜纯化

硅胶柱膜纯化利用硅胶膜表面的硅醇基团与mRNA分子之间的相互作用。在高盐环境下，这些负电荷能够中和，促进mRNA与硅胶膜的结合。而在低盐或水溶液中，mRNA则能够顺利洗脱。此外，硅胶膜对蛋白质、多糖及脂类等杂质几乎不吸附，因此可实现有效分离。这种方法安全无毒，符合环保要求，适用于科研和早期研究阶段。

磁珠法与层析法

在工业级别的纯化中，层析法是提升核酸质量和产量的主要手段。Oligo(dT)亲和色谱是当前纯化mRNA的主流方法，但它无法区分具备Poly(A)尾的ssRNA与dsRNA等杂质。疏水层析与阴离子层析常常与Oligo(dT)亲和色谱联用，以提升纯化效果。

在Oligo(dT)亲和层析中，mRNA通过与Oligo分子配对形成氢键来结合，洗脱后相应的mRNA顺利分离。疏水层析则根据mRNA和杂质的疏水性质差异，实现有效分离。阴离子层析通过目标mRNA与其他杂质之间电荷差异进行纯化，确保其在中性pH条件下结合。

蛋白酶K纯化

在当前工业端的mRNA纯化工艺中，通常采用TFF1-层析-TFF2的流程，减少蛋白、DNA模板和NTP等杂质。最近的工艺开发中，通过添加蛋白酶K，能够高效去除结合的蛋白质杂质，显著提高产物的纯度和完整度。然而，需要注意的是，蛋白酶K可能具有一定的免疫原性，因此其添加量需谨慎优化，以确保mRNA疫苗的安全性和有效性。

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